2025年10月7日 星期二

以此第二種方法得到之胜肽片段也如同前述加以定序及分離。  兩種方法得到之胜肽片段均完成定序之後,將兩者加 以比對,從中找到連續性且互相重疊之序列(圖3- 27)。重疊序列的出現有助於我們瞭解胜肽片段的正確排列順序

 胜肽可由其離子化行為加以區分胜肽僅具一個游離胺基與一個游離羧基,分別位於胜肽鏈狀結構兩端(圖3-15)。這些基團在胜肽中也如同它們在游離態時一樣可以離子化,但其解離常數不同於胺基酸,因為此時帶相反電荷之基團並非聯結在同一個α碳原子上。其他不在末端上的胺基酸之α-胺基與α-羧基均以肽鍵共價聯結在一起,因此無法離子化,也不會對胜肽之整體酸鹼行為作出任何貢獻。 顯示此四肽具有一個游離α-胺基、一個游離 α-羧基與兩個離子化 R 基團。在 pH 7.0 時可離子化基團以紅色表示。 四肽具生物活性的胜肽與多胜肽之大小差異甚鉅許多小分子胜肽在極低濃度就能發揮功效,如一些脊椎動物之激素(荷爾蒙)就是小分子胜肽。  較大一些的胜肽稱為小多肽或寡肽,如胰臟激素-胰島素由兩條多肽組成,一條含30個胺基酸殘基,另一條則為21個。 有些蛋白質由單一多肽鏈組成,但另一些稱為多次單元(multisubunit)蛋白質者,則由兩條或以上的多肽以非共價性鍵結聯結在一起(表3-2)。多次單元蛋白質中的每條個別多肽可能完全相同或不同,如果至少有兩個相同次單元組成之蛋白質稱為寡聚化 (oligomeric)蛋白質;而相同的次單元則被稱為一個原聚體(protomers)。 表 3-2 一些蛋白質之分子資料 有些蛋白質是由兩條或以上之多肽鏈以共價性方式鍵結在一起,例如胰島素的兩條多肽鏈是以雙硫鍵聯結在一起。

胜肽片段排序 先將蛋白質以非胰蛋白酶之另一種蛋白酶或化學試劑加以切割(如溴化氰CNBr僅會切割甲硫胺酸羧基端之肽鍵),以此第二種方法得到之胜肽片段也如同前述加以定序及分離。  兩種方法得到之胜肽片段均完成定序之後,將兩者加 以比對,從中找到連續性且互相重疊之序列(圖3- 27)。重疊序列的出現有助於我們瞭解胜肽片段的正確排列順序。如果胺基端殘基在蛋白切割前就已得知,則能協助我們判斷胺基端片段序列為何。進行兩種方法也有助於排除個別定序上的可能錯誤,如果第二種方法完全無法獲得任何與第一種方法具連續性重疊的序列,則必須嘗試第三、甚至第四種切割方法,以獲得必要的重疊序列。  圖3-27 顯示切割蛋白質、定序及胜肽片段排序。首先決定出蛋白質樣品之精氨酸組成及其胺基端殘基。緊接著將可能有的雙硫鍵還原,以使定序有效進行。在此例中,蛋白質分子僅有兩個半胱胺酸殘基,因此只有一對可能之雙硫鍵形成位置。當多胜肽含有三個或以上的半胱胺酸殘基時,則必須考慮更多可能之組合方式產生雙硫鍵之位置。 圖 3-27 切割蛋白質、定序及胜肽片段排序

但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有轉譯後的修飾作用仍深具價值 蛋白質定序步驟*- 蛋白質純化,可利用蛋白質的大小、帶電特性、溶解度或與特定物質的吸附作用等 - 次單元的分離,可利用高鹽濃度或改變溶液的pH值- N端與C端胺基酸的定性分析- 利用酵素或化學試劑的作用將多肽鏈分割成小片段,確保定序結果的正確性- 胺基酸自動定序 - 序列的重組- 雙硫鍵的定位*,可利用對角線電泳 N端精氨酸定性 FDNB PITC Edman降解反應 蛋白質定序過程 硫鍵的定位- Diagonal electrophoresis (對角線電泳) 其他的定序方法

蛋白質(肝糖磷解酶)因特定胺基酸接上特定的化學基團(磷酸基)後而改變其活性,胺基酸此修飾作用屬共價鍵結的形成,因此活性變化之間需其他酵素的參與* 阻害劑Amplification of signal磷酸化磷酸化 - 共價修飾的調控機制通常是細胞代謝受激素調節的方式,有訊號放大的效果 5. 其他機制與其他蛋白質的接合作用- 如蛋白質激酶A (protein kinase A, PKA)*與調節次單元的接合 - 如調鈣蛋白(calmodulin)可調控受Ca2+調節的蛋白質或酵素 蛋白質的分佈(compartmentation或localization)- 如葡萄糖運輸蛋白的細胞表面受胰島素的影響

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