固相基質帶有負電荷基團。  此時樣品溶液中帶有淨正電荷之蛋白質通過基質之速度會遠較帶有淨負電荷之蛋白質慢，因為前者與基質間產生之交互作用延滯其通過速度。  兩種性質的蛋白質會分成兩個明顯的色帶

 圖3-29 顯示反應至是形成每一個肽鍵所需之步驟。 以 9-茀基甲氧羰基（9-FluorenylMethOxyCarbonyl，Fmoc；藍色區塊所示）作為保護基可避免反應過程中胺基酸殘基（紅色區塊所示）之α-胺基發生副反應。  此化學合成法是由羧基端開始向胺基端合成胜肽，與活體內蛋白質合成方向恰為相反。 圖 3-29 在固相聚合物上胺基酸進行胜肽之化學合成。  胜肽化學合成法現在已可進一步以機器自動化操作進行。

 增加管柱長度將提高分離效果（即解析度增加）；但相對地隨著層析時間的增加，蛋白質色帶隨擴散作用也會持續加寬，此現象則會降低解析度。  以圖中為例，蛋白質 A 可完全與 B 和 C 分離，但 B 與 C 之間則因擴散現象而無法達到完全分離的效果。 圖 3-17 管柱層析法。  個別蛋白質由於其性質之差異會以不同之速度通過層析管柱。胺基酸例如在陽離子交換層析法（cation exchange chromatography）中（圖3-18a），固相基質帶有負電荷基團。  此時樣品溶液中帶有淨正電荷之蛋白質通過基質之速度會遠較帶有淨負電荷之蛋白質慢，因為前者與基質間產生之交互作用延滯其通過速度。  兩種性質的蛋白質會分成兩個明顯的色帶，而蛋白質色帶在移動相中延展的情形會受到兩種因素影響：一是管柱造成性質差異的蛋白質分離的自然現象；二是擴散作用造成的色帶分散現象。  圖3-18(a) 顯示離子交換層析法利用蛋白質在特定 pH 值時之靜電荷差異進行分離。

蛋白質結構可分為數個層級蛋白質結構一般被定義為四個層級（圖3-16）描述整個多肽鏈中用以連結每個胺基酸殘基之共價鍵結 （主要是胜肽鍵與雙硫鍵）者稱為一級結構（primary structure），其主要組成元件即為胺基酸殘基之序列 二級結構（secondary structure）指的是由胺基酸殘基形成的一些特定的穩定排列方式，在蛋白質中會是一再重複出現的結構模式 三級結構（tertiary structure）描述的是多肽的三度空間摺疊 當一蛋白質具有兩個或以上的次單元，則其次單元在空間中之排列則稱為四級結構（quaternary structure）

顯示利用蛋白質之等電點差異進行分離。  先添加適當兩性電解質以製備 pH 值穩定均勻之膠體，精氨酸待測蛋白質混合樣品則置入膠體中之樣品槽，通以電流後各種蛋白質則進入膠體並開始緩慢移動；當移動到與其 pI 值相同之 pH 值才停止。 圖 3-21 等電焦集法。 表 3-6 一些蛋白質之等電點  將等電焦集法與 SDS 電泳組合而成之實驗流程稱為二維電泳（two-dimensional electrophoresis）。  此方法用於分析複雜蛋白質混合物時可大幅提高其解析度（圖3-22）。

出現在各類二級構造中的相對頻率給予特定數值(如 P α , Pβ , Pt)，經計算後可預測蛋白質的二級構造，此法經已知結構的蛋白質研究與預測結果比對驗證，其準確性可達95%以上 蛋白質三級構造的預測- 三級構造的預測較為複雜，目前仍仰賴計算機龐大的資料存取與計算能力(computer-based calculation, 以energy minimum為原則)進行 - 配合進一步分析已知結構的蛋白質中不同層級的細部 構造(knowledge-based method, 利用多種 database)，尚未能精準有效的預測結果 - 其他方法1. 分析不同蛋白質的胺基酸序列，可推斷蛋白質是否為同源蛋白，即源自同一個祖先 2. 以肌紅蛋白與血紅素的研究為例