但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有轉譯後的修飾作用仍深具價值 蛋白質定序步驟*- 蛋白質純化，可利用蛋白質的大小、帶電特性、溶解度或與特定物質的吸附作用等 - 次單元的分離，可利用高鹽濃度或改變溶液的pH值

 因素，即疏水的胺基酸側鏈的分佈- 漏斗模式(funnel model)*中，漏斗為energy landscape (能量圖景，位能鳥瞰)，蛋白質的特有構形所含能量最低，因此最穩定 - 二級構造 →結構區域 →功能區域 →特有立體構形 10. 參與摺疊的蛋白質蛋白質在合成後，胺基酸並非所有蛋白質皆能及時自發地摺疊成正確的構形，其快速正確的摺疊需許多其他蛋白質的協助 分子伴護蛋白(molecular chaperones)- 伴隨蛋白或伴從蛋白(chaperones)*扮演被動 角色，如Hsp70s (熱休克蛋白70)會與未摺疊或部份摺疊的蛋白質接合，避免未摺疊或部份摺疊的蛋白質黏集而被降解，而in vivo 的實驗也顯示伴隨蛋白是蛋白質正確摺疊及形成四級構造所必需的 -

雙硫鍵之形成不僅限於分子內 Y 兩個蛋白質分子間之胺基酸也可形成雙硫鍵而造成交 環狀胜肱胺基酸組成之偏好性生物責訊在生物化學課程中之應用 3 聯(crOss link)。本文針對具有分子內雙硫鍵之胜肱，分析雙硫鍵所形成之環狀序列申胺基酸組成之偏好性 。 三‵方法學員需具備使用網際網路(Intemet)的能力 。 本文使用全球資訊網(WOrId Wide Web)之責源進行蛋白質序列之分析 。 所需之配備為 IBM 相容之個人電腦(486 以上)以及 Netscape Navigator (4﹒0 以上版本) 瀏覽軟體0 實驗之基本步驟可按圖二所建議之流程進 行操作。步硼一 首先需明確設定使用網路資源進行搜尋之具體目的 。 此一目的可由學生提出或由教師整理一清單而由學生挑選 。 胺基酸目的之設定應以考量搜尋過程與分析結果所需之時問，並能闡明相關生物性質為原則。本文將以"比較天然環狀胜肚中各胺基酸出現之機率"為範例進行搜尋 。 環狀胜肱限定為由二半胱胺酸(Cys)形成分子內雙硫鍵之胜肚。而包含此環狀序列之胜肚總長度可先限定在 20個胺基酸以內 】以利初步搜尋之進行。 步′鍺二 選擇資科厙 。 目前網路上與蛋白質序列相關之資料厙中較為完整者為 SWISS﹣PROT 以及 PIRe 此二責料厙之綢址列於表一 。此二網蛣中均具有多重搜尋之功能墜本文中胜肚序列均取自 SWISS﹣PROT(releas639ˍ7)﹙…﹚責料厙。SWISS PROT的特色 在於其周詳之註解系統之責料進行過篩選處理 。 尤為重要的是該資料厙對重複 進入資料厙後即可針對搜尋目的輸入條件 。

但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有轉譯後的修飾作用仍深具價值 蛋白質定序步驟*- 蛋白質純化，可利用蛋白質的大小、帶電特性、溶解度或與特定物質的吸附作用等 - 次單元的分離，可利用高鹽濃度或改變溶液的pH值- N端與C端胺基酸的定性分析- 利用酵素或化學試劑的作用將多肽鏈分割成小片段，確保定序結果的正確性- 胺基酸自動定序 - 序列的重組- 雙硫鍵的定位*，可利用對角線電泳 N端胺基酸定性 FDNB PITC Edman降解反應 蛋白質定序過程 硫鍵的定位- Diagonal electrophoresis (對角線電泳) 其他的定序方法-

胜肽片段排序 先將蛋白質以非胰蛋白酶之另一種蛋白酶或化學試劑加以切割（如溴化氰CNBr僅會切割甲硫胺酸羧基端之肽鍵），以此第二種方法得到之胜肽片段也如同前述加以定序及分離。  兩種方法得到之胜肽片段均完成定序之後，將兩者加 以比對，從中找到連續性且互相重疊之序列（圖3- 27）。重疊序列的出現有助於我們瞭解胜肽片段的正確排列順序。如果胺基端殘基在蛋白切割前就已得知，則能協助我們判斷胺基端片段序列為何。進行兩種方法也有助於排除個別定序上的可能錯誤，如果第二種方法完全無法獲得任何與第一種方法具連續性重疊的序列，則必須嘗試第三、甚至第四種切割方法，以獲得必要的重疊序列。  圖3-27 顯示切割蛋白質、定序及胜肽片段排序。首先決定出蛋白質樣品之精氨酸組成及其胺基端殘基。緊接著將可能有的雙硫鍵還原，以使定序有效進行。在此例中，蛋白質分子僅有兩個半胱胺酸殘基，因此只有一對可能之雙硫鍵形成位置。當多胜肽含有三個或以上的半胱胺酸殘基時，則必須考慮更多可能之組合方式產生雙硫鍵之位置。 圖 3-27 切割蛋白質、定序及胜肽片段排序

增加管柱長度將提高分離效果（即解析度增加）；但相對地隨著層析時間的增加，蛋白質色帶隨擴散作用也會持續加寬，此現象則會降低解析度。  以圖中為例，蛋白質 A 可完全與 B 和 C 分離，但 B 與 C 之間則因擴散現象而無法達到完全分離的效果。 圖 3-17 管柱層析法。  個別蛋白質由於其性質之差異會以不同之速度通過層析管柱。精氨酸例如在陽離子交換層析法（cation exchange chromatography）中（圖3-18a），固相基質帶有負電荷基團。  此時樣品溶液中帶有淨正電荷之蛋白質通過基質之速度會遠較帶有淨負電荷之蛋白質慢，因為前者與基質間產生之交互作用延滯其通過速度。  兩種性質的蛋白質會分成兩個明顯的色帶，而蛋白質色帶在移動相中延展的情形會受到兩種因素影響：一是管柱造成性質差異的蛋白質分離的自然現象；二是擴散作用造成的色帶分散現象。  圖3-18(a) 顯示離子交換層析法利用蛋白質在特定 pH 值時之靜電荷差異進行分離。