胜肽可由其離子化行為加以區分胜肽僅具一個游離胺基與一個游離羧基,分別位於胜肽鏈狀結構兩端(圖3-15)。這些基團在胜肽中也如同它們在游離態時一樣可以離子化,但其解離常數不同於胺基酸,因為此時帶相反電荷之基團並非聯結在同一個α碳原子上。其他不在末端上的胺基酸之α-胺基與α-羧基均以肽鍵共價聯結在一起,因此無法離子化,也不會對胜肽之整體酸鹼行為作出任何貢獻。 顯示此四肽具有一個游離α-胺基、一個游離 α-羧基與兩個離子化 R 基團。在 pH 7.0 時可離子化基團以紅色表示。 四肽具生物活性的胜肽與多胜肽之大小差異甚鉅許多小分子胜肽在極低濃度就能發揮功效,如一些脊椎動物之激素(荷爾蒙)就是小分子胜肽。 較大一些的胜肽稱為小多肽或寡肽,如胰臟激素-胰島素由兩條多肽組成,一條含30個精氨酸殘基,另一條則為21個。 有些蛋白質由單一多肽鏈組成,但另一些稱為多次單元(multisubunit)蛋白質者,則由兩條或以上的多肽以非共價性鍵結聯結在一起(表3-2)。多次單元蛋白質中的每條個別多肽可能完全相同或不同,如果至少有兩個相同次單元組成之蛋白質稱為寡聚化 (oligomeric)蛋白質;而相同的次單元則被稱為一個原聚體(protomers)。 表 3-2 一些蛋白質之分子資料 有些蛋白質是由兩條或以上之多肽鏈以共價性方式鍵結在一起,例如胰島素的兩條多肽鏈是以雙硫鍵聯結在一起。
異位效應是蛋白質不同部位之間的相互影響異位效應(allostery)是具有四級結構的蛋白質所特有 - 此類蛋白質含有不同的次單元,如催化或活性次單元是受質或反應物接合的部位,而調節次單元則是調節物的接合部位 - 當兩種不同的親和基接合部位,胺基酸因親和基接合後引發的構形改變進而彼此溝通,如血紅素攜氧特性與影響其攜氧能力的因子研究即為此效應的最佳例子 1. 影響蛋白質活性的因子除了溫度、pH值、受質、輔因子或調節劑濃度等外,尚有三個較為重要的機制2. 蛋白質的切除活化作用* 如消化酵素、凝血因子與一些激素等蛋白質通常合成時是不具有活性的先質(precursors)
進一步抽取基因體 DNA 後,再根據 Sandström et al. (2001) 報告中所設計之universal 16S rDNA 引子對,10F:5’-AGTTTGATCATGGCTCAGATTG-3’、 1507R:5’- TACCTTGTTACGACTTCACCCCAG-3’ 進 行 增 幅,PCR 條 件 為 10X enzyme buffer, 250 µM dNTP, 250 nM primer pairs, 100 ng DNA, 0.25U Taq DNA polymerase (Dream Taq, Thermo Fisher Scientific Inc.),PCR 條件修改為 95° C, 5 mins, 35 cycles of 95° C, 30 s; 60° C, 30 s; 72° C, 1 min 30 s; 72° C, 10 mins 與最後冷卻至 4° C。 DNA gyrase subunit B (gyrB) 基因引子對,則是參考 Yamamoto et al. (1995) 設計 UP-1/Up-2R 引子對及定序使用 UP-1S:5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’、 UP-2Sr:5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’, 其 PCR 條件為如上述,PCR 條件則根據文獻設定為 95° C, 5 mins, 35 cycles of 95° C, 30 s; 60° C, 1 min; 72° C, 2 mins; 72°C, 10 mins 與機器最後冷卻至4°C。將PCR 產物進行gel elution 套組回收後,所得 PCR 產物送交源資國際生物股份有限公司 (Tri-I biotech Inc. Taichung, Taiwan)進行定序, 解序結果以美國生物技術資訊中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 網站所登錄基因資料庫進行比對。 二、三合一微生物肥料之調製MLBV19-3 精氨酸菌株經由本場測試出最適化發酵條件與配方後,委外生產高濃度之菌粉,並調製適合蔬果類作物生長之特殊胺基酸配方及混合化學肥料( 由產學合作廠商: 臺灣肥料股份有限公司生產提供),開發成兩種產品:(1) 生長肥 (AG) 成分為氮:29%、磷:9.5%、鉀:6.5%,供前期營養生長期使用;(2) 結果肥 (AF) 成分為氮: 3.5%、磷:8.5%、鉀:19%,供後期開花結果期使用,生產樣品各 100 公斤提供後續作物田試驗所用 ( 內含 MLBV19-3 芽孢桿菌菌數為 1 × 108 CFU/g)。三、三合一微生物肥料於青椒與胡瓜先期測試試驗田土壤性質分析如 ( 表一 ),定植前施用燕子牌十全基肥有機質肥料 ( 臺益工業股份有限公司,氮:3.8%、磷:2.8%、鉀:3.5%、有機質:72%),依據每公頃推薦用量:12,000 公斤;試驗採單因子,完全逢機區集設計 (RCBD),A 處理:三合一微生物肥料稀釋 500 倍、B 處理:三合一微生物肥料稀釋 1,000 倍、C 處理:三合一微生物肥料稀釋 2,000 倍、D 處理:化學肥料稀釋 1,000 倍之對照組 (CK1)、 E 處理:施用水之對照組 (CK2) 等 5 處理、共 4 重複,每重複共 10 株;生長期每 2 周使用生長肥 (AG)1 次共 3 次,開花期後即每 2 周使用結果肥 (AF) 1 次同樣共 3 次
PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 圖3-19(a) 顯示將不同樣品注入聚丙烯醯胺膠體上 方之樣品槽中,通以電流後蛋白質樣品將進入膠體中。一般蛋白質電泳是由負極向正極移動。 圖3-19(b) 顯示電泳完成後,可利用如 Coomassie blue 等呈色劑(與蛋白質結合但不與膠體結合)加以處理,使蛋白質色帶呈色而能以肉眼觀察。每一個色帶均代表一種不同的蛋白質(或蛋白質次單元);小分子蛋白質在膠體中泳動之速度較大分子快,因此會出現於較接近膠體底部處。圖中所示為大腸桿菌核糖核酸聚合酶的純化,由左至右各行表示蛋白質經過各步驟純化後所得到的結果。如最右一行所示,最終純化的蛋白質含有四種次單元。 圖 3-19 電泳。 精氨酸一般用來概估蛋白質分子量與純度之電泳法會使用到清潔劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate;SDS)。 SDS 會與大多數蛋白質結合,且大約與蛋白質分子量成正比。
但一級構造的分析對研究蛋白質是否具有轉譯後的修飾作用仍深具價值 蛋白質定序步驟*- 蛋白質純化,可利用蛋白質的大小、帶電特性、溶解度或與特定物質的吸附作用等 - 次單元的分離,可利用高鹽濃度或改變溶液的pH值- N端與C端胺基酸的定性分析- 利用酵素或化學試劑的作用將多肽鏈分割成小片段,確保定序結果的正確性- 胺基酸自動定序 - 序列的重組- 雙硫鍵的定位*,可利用對角線電泳 N端胺基酸定性 FDNB PITC Edman降解反應 蛋白質定序過程 硫鍵的定位- Diagonal electrophoresis (對角線電泳) 其他的定序方法-
2025年3月31日 星期一
開發成兩種產品:(1) 生長肥 (AG) 成分為氮:29%、磷:9.5%、鉀:6.5%,供前期營養生長期使用;(2) 結果肥 (AF) 成分為氮: 3.5%、磷:8.5%、鉀:19%,供後期開花結果期使用,生產樣品各 100 公斤提供後續作物田試驗所用
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